非编码RNA是生物体内存在的一类不编码蛋白质的RNA。人们曾经认为，信使RNA（mRNA）必须翻译成蛋白才能行使功能，而其他不编码蛋白的RNA主要是辅助mRNA的翻译（tRNA和rRNA）和成熟（snRNA）。随着生命科学研究的深入和基因测序技术的快速发展，人们发现细胞中还存在大量的具有不同功能或功能未知的非编码RNA。20世纪90年代，研究发现线虫的lin-4基因编码一个22 nt的RNA，与lin-14的3’非翻译区（untranslated region，UTR）通过碱基配对的方式结合，抑制后者的蛋白翻译，由此调控lin-14的表达^[1]。差不多同时，植物学家发现了基因共抑制现象（co-suppression）^[2]。在矮牵牛中用35S启动子过量表达查尔酮合酶（chalcone synthase, CHS）基因，不仅没有增加CHS转录本，反而导致其转录水平大幅降低并积累大量降解的mRNA片段^[2]。共抑制的一个显著特点为内源和外源转入的基因转录本都显著减少，因此又被称为转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS）。1998年，Waterhouse等^[3]发现受病毒感染的植物能产生与病毒基因组同源的正义和反义RNAs，介导病毒RNA迅速降解从而有效地抵御病毒侵染，因此双链RNA分子（dsRNA）能够触发植物PTGS。同年，人们在对线虫的研究中发现了RNA干扰（RNA interference，RNAi），即外源添加的dsRNA能够引发线虫相应基因的沉默^[4]。这两项独立的发现揭示了非编码RNA通过RNAi调控基因表达是真核生物中普遍存在的现象。此后RNAi被迅速发展成为遗传分析、疾病治疗以及植物保护等方面的有效新技术。在农业上，Bt转基因技术对鳞翅目害虫的控制效果显著。然而这一技术也有它的局限，很多刺吸式昆虫包括蚜虫、飞虱等对Bt毒素不敏感，并且随着Bt作物的广泛种植，田间已出现对Bt产生抗性的昆虫。基于RNAi的抗虫技术广泛适用于包括刺吸式在内的多种昆虫，弥补了Bt转基因技术的不足之处，有望成为新一代控制虫害的主要手段之一。

1 非编码RNA在植物抗虫防御反应中的作用

植物固着生长，不能自由移动，因此需要对周围的各种胁迫环境如干旱、土壤盐分、极端气温以及病虫害等具有更高的耐受力与适应性。研究发现内源非编码RNA在植物对病毒防御机制中发挥重要的作用^[5]，在逆境和抗病反应中担当重要角色^{[6, 7]}。以拟南芥为例，miRNA398对植物多种逆境反应具有直接的调控作用，包括氧化应激反应、水分亏缺、盐胁迫以及脱落酸（ABA）响应等^[8]。miR393通过对生长素信号途径促进植物对病原菌的抗性^[9]；有趣的是，miR393的互补链（miR393b*）在体内也存在靶基因（MEMB12）；在拟南芥受到丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）侵染时，AGO2作为RNA沉默系统的重要组分被显著诱导，通过结合miR393b*抑制MEMB12的表达，从而抵御病原菌的侵染^[10]。此外，非编码RNA在植物对昆虫的防御过程中也扮演着举足轻重的角色。

1.1 RNAi对植物防御信号途径的调节作用

茉莉素（JA）、乙烯（ET）、脱落酸（ABA）和水杨酸（SA）是植物中重要的防御激素，它们帮助植物适应生物和非生物胁迫等不良环境。JA诱导植物对植食性昆虫的防御反应，植物在受到昆虫取食后，JA信号途径被迅速激活，激活防御基因表达，导致具有抗虫活性的植保素的合成与积累^[11]。除JA外，ET也参与植物抗虫途径的调控。ET途径受阻使得渐狭叶烟草（Nicotiana attenuata）对烟草天蛾（Manduca sexta）以及玉米（Zea mays）对草地夜蛾（Spodoptera frugiperda）的取食变得更为敏感^{[12, 13]}。

在渐狭叶烟草中，利用dsRNA抑制依赖于RNA的RNA聚合酶1（RDR1）的表达，植物的抗虫性降低^[14]。RDR1与内源siRNA的合成有关，是siRNA介导基因沉默的关键因子。由此推测，烟草对植食性昆虫的抗性与RNAi密切相关。进一步研究发现，抑制RDR1表达可以削弱由昆虫口器分泌物激发的JA和ET信号通路。对烟草小RNA表达谱的分析发现，RDR1表达抑制对植食性昆虫取食引起的小RNA类群变化有显著影响，在这些发生变化的小RNA中，有很大一部分与防御激素（JA、ET）信号途径的调控基因同源^[15]。

更为精细的遗传与生化分析表明，RNAi在ET信号途径中的确具有重要的调节作用，ET途径的多个关键调控因子受到细胞质RNA5ʹ—3ʹ和3ʹ—5ʹ降解途径的调控^{[16, 17]}。负责细胞质RNA降解的突变体ein5对ET信号敏感性降低^[17]。如果细胞质RNA5ʹ—3ʹ和3ʹ—5ʹ降解途径同时受阻，植物就会表现出严重的发育缺陷，并且有一定比例的胚胎致死。有趣的是，在RNAi途径相关突变体rdr6中，RNA降解途径受阻引起的发育缺陷表型基本得到回复。高通量测序分析发现，细胞质RNA降解途径受阻后，多个（441个）蛋白编码基因产生了大量长度为21—22 nt的次级小干扰RNA（ct-siRNA），它们由RDR6-DCL4/2途径产生，对相应同源基因的表达有明显抑制作用^[16]。这些结果揭示了RNAi途径对乙烯途径相关的胞质RNA降解途径具有调节作用，在胞质RNA降解途径受阻的情况下，能够以RNAi的方式降解多余的RNA；细胞质RNA降解途径具有抑制细胞内正常转录本PTGS的作用。

1.2 微RNA（miRNA）在植物抗虫途径中的作用

miR156是植物中一类相当保守的miRNA，其靶基因编码SPL家族转录因子，miR156-SPL模块在植物从营养生长期向生殖生长期的转换过程中起关键调控作用。除了影响植物的生长发育，miR156-SPLs也参与控制多种植物次生代谢化合物的合成以及表皮毛的形成。表皮毛分布在植物地上器官的表面，对前来取食的昆虫形成物理屏障，是植物抗虫的一种重要手段。对拟南芥表皮毛分布调控机制的研究发现，SPL9能够直接结合负调因子基因TCL1的启动子。随着植物生长，miR156水平不断降低而SPL9逐渐增高，TCL1基因表达水平随之增高，从而抑制表皮毛在花序轴和花器官上的形成。如果用35S启动子过表达miR56，拟南芥在抽苔后产生大量异位表皮毛^[18]。与miR156相反，miR171则抑制表皮毛形成。进一步研究发现受miR171调节的LOM蛋白通过与miR156靶向的SPLs相互作用来协调拟南芥表皮毛的分布和植物营养生长到生殖生长的时相转化^{[19, 20]}。

植物次生代谢产物往往与生物互作密切相关，其中很大一部分是抵御昆虫和病原微生物侵袭的植保素。花青素是植物中常见的次生代谢产物，研究发现miR156-SPLs参与植物对花青素合成的调控。高水平的miR156能够促进花青素的积累，而降低miR156的水平导致花青素含量随之降低并伴随黄酮醇的积累。miR156的靶基因SPL9与花青素合成调控MYB类转录因子PAP1存在互作，干扰花青素途径MYB-bHLH-WD40转录激活复合体的活性^[21]。萜类化合物是植物次生代谢产物中最为丰富的一类^{[22, 23]}。植物在受到昆虫取食后，许多挥发性萜类被诱导合成并大量释放。植物挥发性成分具有驱避昆虫取食，吸引传粉者或害虫天敌等功能^{[24, 25]}。在拟南芥中倍半萜成分β-石竹烯的合成受到miR156-SPLs的调控，SPL能够直接结合β-石竹烯合酶基因TPS21的启动子，激活其转录。在唇形科香料植物广藿香（Pogostemon cablin）中，广藿香醇的合成也同样受到miR156-SPLs的调控^[26]。

在拟南芥中防御激素JA的合成受到miR319的负调控^[27]。miR319的靶基因编码一组TCP家族转录因子，包括TCP2，TCP3，TCP4，TCP10和TCP24。人们发现JA合成途径关键酶LOX基因的启动子区域存在这类TCP转录因子的识别元件，TCP能够直接激活LOX的转录，参与JA合成途径的调控。有趣的是，miR319靶向的TCP4与miR156靶向的SPL9在体内具有结合互作的活性，这种结合在一定程度上削弱了TCP4对下游基因的转录激活^[28]。推测在拟南芥中，JA合成途径可能受到多个miRNA的调控。

1.3 非编码RNA与植物防御记忆

研究发现，野萝卜（Raphanus raphanistrum）受到菜粉蝶（Pieris rapae）侵袭后，下一代对菜粉蝶的抗性有明显提高^[29]。对猴面花（Mimulus guttatus）进行机械损伤处理，模拟昆虫取食；连续处理七代后，从处理组得到的植物后代相比于没有处理的植物具有更多、更密集的表皮毛^[30]。这些结果说明植物对昆虫取食产生防御反应的能力具有一定的记忆作用和继代效应。越来越多的研究证明，多种植物的隔代记忆现象与表观遗传密切相关^[31]。表观遗传是指染色体的表观修饰（DNA的甲基化和组蛋白修饰等）可以遗传至下一代。已有证据表明，非编码RNA尤其是siRNA在表观修饰的调控中起重要作用^{[32, 33]}。对拟南芥抗虫记忆的研究初步表明，植物对昆虫的侵袭具有隔代记忆，并且这种隔代记忆依赖于JA响应途径；在JA响应突变体coi1中，抗虫防御的隔代记忆现象消失了。有意思的是，在siRNA合成途径的突变体中（dcl2，dcl3，dcl4和nrpd2a，nrpd2b），也未发现对昆虫防御记忆的遗传效应^[34]。上述结果暗示siRNA和JA信号这两个途径都参与了植物抗虫反应的记忆效应。

2 植物介导的昆虫RNAi 2.1 植物介导的昆虫RNAi现象的发现

早在1998年，人们发现线虫在取食表达与GFP基因匹配的dsRNA细菌时，可以将dsRNA吸收到体内，导致线虫中的GFP基因表达受到抑制^[4]。这说明RNA沉默信号可以通过取食进入生物体内并行使功能。2007年Mao等^[35]发表了植物介导昆虫RNA干扰的研究结果。棉属植物含有棉酚及相关倍半萜醛类，这些成分对昆虫具有普遍毒性。棉铃虫（Helicoverpa armigera）P450单加氧酶基因CYP6AE14在其中肠高表达并且可被棉酚诱导，与幼虫对棉酚的耐受性紧密相关。为抑制CYP6AE14表达，Mao等^[35]根据CYP6AE14序列设计了dsRNA，转入植物表达。棉铃虫取食转基因植物后中肠中CYP6AE14的表达水平降低，对棉酚的耐受性下降。同年，孟山都研究小组在玉米中表达玉米根虫（Diabrotica virgifera）V-type ATPase的dsRNA，得到的转基因植物抗虫性明显提高^[36]。这两个独立的发现，为发展基于RNAi的新一代抗虫植物奠定了基础。

随着研究的深入，人们发现植物介导的昆虫RNAi现象普遍存在于包括咀嚼式和刺吸式在内的多种昆虫中^{[37, 38]}。这说明dsRNA或其基因沉默信号分子可跨物种、跨界传播，这为生物间互作和植物抗病研究提供了新思路。RNAi技术具有较高的选择性与特异性，有望成为有害生物控制的重要新技术。在植物中表达小麦叶锈菌（Puccinia triticina）致病基因的dsRNA削弱了病原菌对植物的侵染^[39]。RNAi信号在宿主植物和寄生植物之间的传播，可用来控制寄生植物的蔓延^[40]。我们最初的工作是利用模式植物拟南芥和烟草开展的，随后证明表达转基因棉花也能抑制棉铃虫相关P450基因的表达，对棉铃虫的抗性明显提高^[41]。

2.2 RNAi抗虫技术的发展

靶基因的有效性和基因沉默的效率是RNAi抗虫技术得以成功的关键。自RNAi抗虫技术报道以来，人们一直在寻找适用于这一技术的有效靶基因，然而很多关于dsRNA抗虫植物的报道显示，虽然植物的抗虫性有所提高，但与目前成熟的Bt作物比较相去甚远。棉铃虫HaNV2基因编码一个定位于线粒体的NDPH脱氢酶黄素蛋白2（NDUFV2），对于细胞能量代谢具有重要作用。我们课题组最近的研究表明，通过植物介导的RNAi抑制棉铃虫HaNV2的表达，可导致其幼虫中肠近绒毛位置的线粒体数目明显减少，且线粒体发育异常，呼吸链功能受到严重影响。表达棉铃虫dsHaNV2的转基因棉花表现出较强的抗虫能力，取食的棉铃虫幼虫死亡率高达80%以上，与目前广泛应用的Bt抗虫棉效果相当^[42]。

与内源性的RNAi不同，植物介导的昆虫RNAi需要将植物中的dsRNA通过昆虫的取食与消化系统传递到昆虫细胞内，因此dsRNA在昆虫中肠的吸收，在很大程度上决定着RNAi的效率。昆虫中肠外侧包裹着一层叫围食膜的组织，由几丁质以及大量的糖蛋白组成，是dsRNA进入昆虫细胞时遇到的第一道屏障。人们发现植物半胱氨酸蛋白酶能够破坏昆虫围食膜结构，增加中肠通透性；将dsRNA和半胱氨酸蛋白酶在植物中共表达，显著提高了RNAi效率^[43]。提高dsRNA的表达量是增加RNAi效率的另一个重要渠道。最近的两项研究发现，利用质体表达体系可以显著提高dsRNA在植物中的产生与积累，从而有效地提高植物对昆虫的抗性^{[44, 45]}。

3 展望

随着对非编码RNA研究的深入，人们对RNA和基因表达调控有了新的认识。例如，有报道发现植物中有些miRNA转录前体（pre-miRNA）具有短的开放阅读框，除了产生成熟的miRNA，还能被翻译成小肽行使功能^[46]。最近的研究显示，来自病原菌的siRNA可通过侵染向植物传播，同时植物的siRNA也可以进入病原菌，并且这些siRNA在植物—病原菌互作中起重要作用^{[47, 48]}。可见，植物非编码RNA可作为直接的信号分子跨界传播，在植物与环境的互作中发挥重要作用。植物非编码RNA尤其是长非编码RNA的研究还存在许多尚未开垦的领域，需要更多的工作来发现新的非编码RNA并阐明其生成途径、作用机制以及生物学功能。目前的研究主要局限于少数模式植物，除了水稻，其他作物的非编码RNA研究报道较少。在农业上，利用RNAi技术控制虫害已经成为热点。与传统抗虫蛋白转基因相比，这一技术更具选择性和安全性。然而，虽然植物介导的昆虫RNAi说明dsRNA或其沉默信号可在不同物种间传播，但是RNA沉默信号的传播机制还不清楚，这在很大程度上限制了技术的发展和应用。无疑，非编码RNA的功能研究及其应用具有诱人的发展前景，将引起广大生物学、医学和农学工作者更大的兴趣。